Nobel hóa học 2008 - Kỳ 2: Câu chuyện của những Prometheus-Từ đại dương đến phòng thí nghiệm  


Ánh sáng kì diệu

Trần Thanh Long

Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử, khoa Sinh học-Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM

Kỳ 2: Câu chuyện của những Prometheus

Từ đại dương đến phòng thí nghiệm

Theo thần thoại Hi Lạp, Prometheus là một titan đã bí mật ăn cắp lửa của các vị thần ở Olympus để tặng cho loài người cũng như chỉ cho họ cách sử dụng lửa. Từ đó, mỗi khi đêm về, loài người không còn phải chịu cảnh sống trong bóng tối. Ba nhà khoa học đoạt giải Nobel cho các công trình nghiên cứu về GFP cũng giống như Promethius trong thần thoại khi đã mang một nguồn ánh sáng kì diệu từ tự nhiên về cho thế giới khoa học, không những vậy, họ còn mở ra cho các nhà nghiên cứu cách sử dụng GFP để soi sáng những bí mật của sự sống.

Như đã giới thiệu ở kì trước, câu chuyện về hành trình khám phá GFP bắt đầu vào mùa hè năm 1961, một năm sau khi Osamu Shimomura đến Mĩ. Vào mỗi mùa hè, ông và các đồng nghiệp đều lái xe 5000 km từ Princeton đến cảng Friday ở bang Washinton để thu thập sứa Aequorea aequorea. Sau khi thu nhận phần cơ quan phát sáng (phần rìa của thân sứa), họ bắt tay vào việc tách chiết hợp chất phát quang. Ở thời điểm đó, đa số các nhà khoa học tin rằng tất cả các hiện tượng phát quang sinh học trong tự nhiên đều tuân theo cơ chế luciferin – luciferase (luciferin là tên gọi chung các hợp chất hữu cơ nhỏ và là cơ chất của phản ứng phát quang xúc tác bởi các enzyme luciferase), nhóm của Osamu khi đó cũng cho rằng khả năng phát sáng của sứa Aequorea aequorea cũng là do phản ứng trên. Vì vậy, Osamu và cộng sự cố gắng tách luciferin và luciferase từ phần cơ quang phát sáng của sứa. Tuy nhiên, mọi phương pháp được nhóm của Osamu sử dụng đều không thành công. Sau nhiều lần thất bại, Osamu cho rằng nguyên nhân nằm ở chính giả thuyết về cơ chế phát sáng luciferin mà cả nhóm theo đuổi ngay từ đầu, có thể, ở loài sứa này, chúng phát sáng theo một cơ chế khác. Tin tưởng vào trực giác của mình, Osamu quyết định từ bỏ việc cố gắng tách chiết luciferin và bắt đầu tìm cách phân tách chất phát huỳnh quang ở sứa. Với hướng đi mới này, Osamu lại gặp một khó khăn khác, nếu chất phát quang của Aequorea aequorea không phải là những luciferin thì bản chất hóa học của những chất đó là gì? Nếu không biết được bản chất hóa học của chất mục tiêu thì việc tách chiết chất đó sẽ rất khó khăn. Ngoài ra, Osamu còn thấy rằng, sự phát sáng của mẫu cơ quan sứa sẽ làm giảm dần lượng chất phát quan còn hoạt tính, vì vậy vấn đề thứ hai là phải ức chế hoạt động chất phát quang trong quá trình tách chiết để tránh hao hụt. Suốt một thời gian vật lộn với hai vấn đề trên, cuối cùng, Osamu cũng có một ý tưởng hết sức đơn giản: khác với các loài phát quang đã biết, có thể ở loài sứa này, chất phát quang là protein, và protein thì có thể được ức chế thuận nghịch (ức chế và sau đó hồi phục hoạt tính khi cần) ở một pH nhất định. Để kiểm chứng ý tưởng trên, Osamu kiểm tra sự phát quang của mẫu sứa ở các mức pH khác nhau, kết quả có thể rõ ràng thấy được là sự phát quang diễn ra ở các pH 7, 6, 5 nhưng chấm dứt ở pH 4, sự phát huỳnh quang lại xuất hiện trở lại khi môi trường chứa mẫu sứa được trung hòa. Từ phát hiện trên, Osamu đã xây dựng quy trình tách chiết protein phát huỳnh quang ở pH thấp. Thành quả của nhóm là việc thu nhận được protein phát huỳnh quang xanh lam khi có sự hiện diện của ion calcium, protein này được đặt tên là aequorin. Trong quá trình tinh sạch aequorin, các nhà khoa học còn phát hiện có một protein có số lượng rất ít lẫn với aequorin, protein thứ hai này cũng được tinh sạch và sau này được đặt tên là GFP (green fluorescent protein). [1]

Vào thời điểm cả hai protein được tìm thấy, aequorin lặp tức gây được sự chú ý của giới khoa học và được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng như một chất cảm biến sự hiện diện của ion calcium trong tế bào. Trong khi đó, GFP lại bị xem như là tạp nhiễm trong quá trình tách chiết aequorin. Tuy nhiên, bản tính tò mò của các nhà khoa học vẫn thôi thúc họ nghiên cứu kĩ hơn về thứ tạp nhiễm kia. Do mục tiêu ban đầu của nhóm Osamu là thu nhận aequorin và GFP chỉ tồn tại ở một lượng rất nhỏ sau mỗi lần tinh sạch aequorin nên mãi đến năm 1979, Osamu mới có đủ lượng protein GFP (100 mg) [1] để nghiên cứu. Đầu tiên, Osamu sử dụng enzyme papain để phân cắt GFP thành nhiều phần nhỏ, sau đó cô lập và tinh sạch đoạn peptide có chứa cấu trúc chromophore (là phần cấu trúc quyết định màu sắc của một phân tử) và nghiên cứu cấu trúc của chromophore. Osamu vô cùng ngạc nhiên khi phát hiện phổ hấp thụ (absorption/excitation spectrum) của chromophore của GFP gần như tương đồng với phổ hấp thụ của một hợp chất được Osamu tổng hợp trong một công trình nghiên cứu về luciferin-luciferase của loài Cypridina hai mươi năm trước. Dựa trên sự tương đồng về phổ hấp thụ và một số đặc tính khác, Osamu nhanh chóng xác định được cấu trúc chromophore của GFP (p-hydroxybenzylidene-imidazolidone - phân tử nhỏ với thành phần phát sáng chính là dị vòng imidazolidone liên hợp với vòng phenol của amino aicd tyrosine 66, dị vòng được hình thành giữa tyrosin và glycin và serin. Khả năng phát quang và sự hình thành của chromophore sẽ được giải thích kĩ hơn ở bên dưới). [1] [2]

Cùng với nhiều nhà khoa học khác trên thế giới, trình tự amino acid và cấu trúc bậc ba của GFP cũng như cấu trúc của chromophore đã dần được khám phá trong thập kỉ 80 của thế kỉ trước. GFP là một protein gồm 238 amino acid. Cấu trúc bậc ba của GFP đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành chromophore cũng như khả năng hấp thụ và phát xạ ánh sáng của cấu trúc này. Sau này, một số protein phát huỳnh quang phát hiện ở san hô, mực… cũng có có cấu trúc giống với GFP đến kì lạ mặc dù phổ hấp thụ, phát xạ của các protein này khác xa nhau cũng như các loài mang protein phát huỳnh quang này không hề có họ hàng gần với nhau (các protein phát huỳnh quang ở các loài sinh vật trên tuy có cấu trúc gần giống nhau nhưng sự khác biệt nhỏ về cấu trúc chromophore làm các protein này có phổ hấp thụ và phát xạ khác nhau. Các dẫn xuất phát huỳnh quang khác nhau của GFP sẽ được giới thiệu ở phần sau). Chuỗi polypeptide GFP gấp cuộn thành cấu trúc bậc ba có dạng khối trụ gần như hoàn hảo với đường kính đáy khoảng 24 Å và chiều cao khoảng 42 Å. Phần thân của khối trụ tạo bởi 11 phiến β xếp song song với nhau và hai đầu của khối trụ được che chắn bởi những đoạn ngắn xoắn α. Cấu trúc chromophore nằm ở trung tâm khối trụ, được cách li với môi trường bên ngoài và được bảo vệ khỏi sự tấn công từ oxy phân tử hoặc ion hydro (H+) – các nhân tố có khả năng cản trở khả năng phát xạ ánh sáng của chromophore. [2] [3] [4]

Hình 1: Cấu trúc bậc ba GFP; a: nhìn ngang; b: nhìn dọc; amino acid đầu tiên của GFP có màu đỏ, amino acid cuối cùng của GFP màu xanh dương. Thành phần chromophore: nguyên tử carbon màu trắng, nitrogen màu xanh dương, oxygen màu đỏ. [2]

Với cấu trúc đặc biệt của mình, GFP rất bền vững khi tiếp xúc với các chất có khả năng biến tính protein mạnh (những chất can thiệp và phá vỡ các liên kết không cộng hóa trị (non covalent) trong phân tử protein, biến protein bậc ba thành chuỗi polypeptide bậc một) như urea, guanidinium chloride; hơn thế nữa, GFP còn bền vững trước các loại enzyme phân giải protein như trypsin và pronase bất chấp sự xuất hiện của các trình tự nhận biết chuyên biệt cho các enzyme trên trên bề mặt GFP. [2] [4]

Sau đặc tính bền vững đáng kinh ngạc, khả năng phát huỳnh quang là điểm đặc biệt kế tiếp của GFP. Sự gấp cuộn đúng của chuỗi polypeptide để tạo thành cấu trúc bậc ba đóng vai trò then chốt cho sự phát xạ huỳnh quang của GFP. Như đã đề cập, cấu trúc đặc biệt của GFP giúp bảo vệ chromophore khỏi các tác nhân ức chế phát xạ ánh sáng. Ngoài ra, cấu trúc nội phân tử của GFP còn đóng vai trò hình thành một mạng lưới liên kết hydro giữa chromophore và các amino acid xung quanh, mạng lưới liên kết này giúp ổn định và ngăn ngừa chromophore chuyển sang các dạng cấu hình không phát xạ (khi các nguyên tử của chromophore tiếp xúc với photon ánh sáng với bước sóng phù hợp, các electron của chúng sẽ chuyển sang trạng thái kích thích, khi các electron này chuyển về trạng thái nghỉ, chúng sẽ đồng thời phát xạ ra các photon ánh sáng mới với bước sóng lớn hơn, đó là nguồn gốc của huỳnh quang do GFP phát ra. Tuy nhiên, chỉ có chromophore trong GFP gấp cuộn đúng mới có khả năng phát sáng còn chromophore tự do sẽ hình thành các trạng thái nghỉ không có khả năng phát xạ). GFP tự nhiên hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 395 nm (ánh sáng tím) và hấp thụ yếu hơn ở bước sóng 475 nm (ánh sáng xanh lam). Trạng thái kích thích ở cả hai bước sóng trên đều dẫn đến sự phát huỳnh quang xanh lục ở hai bước sóng 503 nm (khi kích thích bởi ánh sáng bước sóng 475 nm) và 508 nm (kích thích bởi ánh sáng bước sóng 395 nm). Sở dĩ GFP có thể hấp thụ được ánh sáng ở hai bước sóng khác nhau (395 nm và 475 nm) là do mạng lưới liên kết hydro xung quanh chromophore có thể thúc đấy sự dịch chuyển proton giữa chromophore và mạng lưới liên kết hydro, dẫn tới sự tồn tại hai trạng thái khác nhau của chromophore kích thích là trạng thái trung hòa (hấp thụ ánh sáng 395 nm) và trạng thái anion (hấp thụ ánh sáng 475 nm). Do trong tự nhiên, GFP ở trạng thái anion tồn tại ở số lượng nhỏ hơn so với GFP dạng trung hòa nên về tổng thể, GFP hấp thụ mạnh nhất ánh sáng 395 nm. [2] [3] [4]

Hình 2: Các góc quay có thể có xung quanh cầu nối carbon của chromophore. Khi không có mạng lưới liên kết hydro bao phủ, chromophore có thể quay theo những góc này và không thể phát quang. [2]

Hình 3: Mạng lưới liên kết hydro do các amino acid và phân tử nước hình thành xung quanh chromophore. [2]

Hình 4: Trạng thái trung hòa của chromophore, hấp thụ ánh sáng 395 nm. Mũi tên xanh: sự dịch chuyển proton diễn ra khi chromophore trung hòa bị kích thích bởi ánh sáng 395 nm. [2]

Hình 5: Trạng thái anion của chromophore. [2]

Điểm đặc biệt cuối cùng của GFP chính là khả năng tự hình thành cấu trúc chromophore bên trong phân tử mà không cần sự giúp đỡ của bất kì enzyme hoặc chất xúc tác nào khác ngoài oxi phân tử (quá trình tự hình thành chromophore cũng là lần duy nhất cấu trúc này tiếp xúc với oxi, sau khi phát triển hoàn chỉnh, chromophore sẽ được toàn bộ phần còn lại của cấu trúc GFP bảo vệ khỏi oxi). Do cấu trúc vòng của chromophore cũng như khả năng phát xạ tài tình của nó, vào thời gian đầu khi giới khoa học vừa tìm ra cấu trúc GFP, không một ai tin rằng GFP có thể tự thân tạo ra chromophore chỉ bằng cách sắp xếp hợp lí các amino acid, hầu hết các nhà nghiên cứu đều nghĩ đến sự trợ giúp của một enzyme đặc biệt nào đó chỉ có trong tế bào sứa Aequorea aequorea, đây cũng là lí do ngăn cản các nhà khoa học ứng dụng GFP vào các công trình nghiên cứu khác. Sự hình thành chromophore có thể được chia thành bốn giai đoạn: sự gấp cuộn của chuỗi polypeptide -  sự đóng vòng - sự khử nước và dehydro hóa - sự oxi hóa. Đầu tiên, sau quá trình dịch mã tổng hợp nên chuỗi polypeptide GFP, các amino acid của chuỗi hình thành các liên kết và tương tác không cộng hóa trị với nhau, từ đó gấp cuộn thành cấu trúc bậc ba của GFP. Do sự gấp cuộn này, các amino acid serine, tyrosine và glycine ở ba vị trí 65, 66, 67 bị ép sát vào nhau. Từ đó, nguyên tử nitrogen của nhóm amide ở Gly67 đóng vai trò như một nucleophile (chất cho một cặp electron cho chất khác để hình thành liên kết cộng hóa trị mới) và tấn công nhóm carbonyl của Ser65. Kết quả của quá trình trên là sự đóng vòng, tạo thành vòng imidazolinone. Sau đó, vòng imidazolinone bị khử nước khử hydro. Cuối cùng, oxi phân tử sẽ oxi hóa cầu nối giữa carbon α và carbon β của Tyr66 để tạo thành cấu trúc chromophore hoàn chỉnh. [1] [2] [3] [4]

Hình 6: Quá trình hình thành chromophore của GFP sau khi chuỗi polypeptide đã gấp cuộn: Đóng vòng - Khử nước/Dehydro hóa - Oxi hóa. [2]

Từ đầu thập kỉ 90, quần thể sứa Aequorea ở cảng Friday suy giảm nghiêm trọng một cách bí ẩn. Do vậy, việc thu nhận thêm aequorin và GFP từ tự nhiên trở nên bất khả thi. Tuy nhiên, điều may mắn với giới khoa học là gene aequorin và GFP đã được dòng hóa (thu nhận và bảo tồn một gene mục tiêu bằng cách chèn gene đó vào bộ gene của một vi sinh vật (thường là vi khuẩn hoặc virus), sau đó cho tế bào vi sinh vật phân chia để tạo thành một quần thể cùng mang gene mục tiêu) thành công. Từ đó, protein aequorin và GFP thu nhận từ tự nhiên không còn cần thiết. [1]

(Còn tiếp)...

 

Tài liệu tham khảo:

[1]

O. Shimomura, "Discovery of Green Fluorescent Protein (GFP) (Nobel lecture)," Angewandte Chemie, vol. 48, pp. 5590-5602, 2009.

[2]

T. D. Craggs, "Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation," Chemical society reviews, vol. 38, p. 2865–2875, 2009.

[3]

M. Ehrenberg , "Scientific background on the Nobel Prize in Chemistry 2008 - The green fluorescent protein: discovery, expression and development," 2008. [Online]. Available: https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/advanced-chemistryprize2008.pdf.

[4]

Z. Marc, "Green fluorescent protein (GFP): Applications, structure, and related photophysical behavior," Chemical reviews, vol. 102, p. 759−781, 2001.

Category: